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诺贝尔化学奖官方解读:原子层面看清生命的本质

13 10月 , 2019  

结构生物学家工具箱中的每种技术都提供了不同的视角。生物学家相信,使用混合方法构建的模型可以准确地反映分子或复合体在细胞中的行为。Meiler说:“你需要把这些技术结合起来,才能得到全面答案。”

由于冷冻电镜除了观察不平整的表面之外,罕有用武之地,因此这种方法有时被嘲笑是“只能看见一坨东西的技术”(blobology)。

学界已经做出了一些努力:目前已建立二维电子显微镜图像档案库和三维的EMDataBank。这些档案库由EMBL等机构提供资金,其中包含的数据可以共享、归档和分发。

雅克·杜邦内特、约阿希姆·弗兰克以及理查德·亨德森的突破性贡献让冷冻电镜技术得以成为现实。这项技术将生物化学技术带入了一个崭新的时,让科学家们获取高分辨率生物分子图像变得前所未有的容易。

NMR于20世纪40年代被首次应用到实验中。研究人员在外部磁场中激发原子得到大分子结构。当原子恢复后,其内部磁场的变化可以被检测到,从而反映出分子的原子结构。然而,核磁共振光谱只适用于相对较小的大分子或复合体。

在1975年,亨德森使用葡萄糖来保护样品,防止他的细胞膜样品干涸。但这种方法不适用于水溶性的生物分子。其他研究者曾经尝试冷冻样品,因为冰的蒸发速度要比水慢,但冰的晶体结构会扰乱电子束流,导致产生的图像是无效的。

不过,对于结构生物学家而言,该技术虽然分辨率高,但也有局限性。首先,样品要高度纯化,以产生有序的晶体。科学家通过分析原子如何散射光确定分子结构。该技术需要有足够的原子,以产生可测量的衍射图案,并且每一个晶体必须是静态的。因此,该方法不能揭示一个分子是如何运动的以及如何起作用的,也不能揭示它如何与其他系统互动。

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最后,结构生物学家必须学会提问题,提出新的、复杂的、以前被认为不可能的生物问题。Ellenberg还表示,多亏混合方法,“很多5年前我甚至以为直到退休都没法探索的问题能解决了”。

在接下来的数年间,电子显微镜技术逐渐完善。镜片质量得到了改善,低温冷冻技术也有了新的进步。在进行观察之前,先利用液氮对样本进行快速冷冻,从而避免其受到电子束流的损伤。得益于这些技术进步,理查德·亨德森逐渐为她研究的细菌视紫红质蛋白图像加入更多细节。为了获得最佳分辨率,亨德森遍访世界各地最好的电子显微镜设备。最终,到了1990年,在他发表第一份细菌视紫红质立体模型整整15年后,亨德森达成了自己当年许下的目标:他对外发布了分辨率达到原子层面的细菌视紫红质立体图像(图三)。

但冷冻电镜要求标本被冰冻。这并不理想,因为冷冻的样本远远脱离了自身动态、天然的状态。而核磁共振光谱可以解决这个问题。Schroder表示,“核磁共振有一个很大的优势,你可以在室温下观察样本,蛋白质的动态信息。”他的实验室通过整合NMR、冷冻电镜和晶体学数据,建立实验模型。

【嵌牛正文】:

现在,科学家拥有一个庞大的成像工具库。低温电子显微镜或化学家的核磁共振成像等方法,都能在不结晶的情况下,获得接近原子分辨率的结构图像,从而揭示分子的形状、大小和方向。但并非所有方法对活细胞内的全部蛋白质、核酸都有用。

当电子显微镜在1930年代被最早发明出来时,科学家们认为其只适合对“死的”物质进行研究。获得高分辨率图像所需的强烈电子束流会破坏生物材料样品,而如果降低电子束流强度,成像质量则会大幅下降。

RNA聚合酶 图片来源:美国斯坦福大学

姓名:祝双    学号:16040520067

经验证明,没有一个单一的方法足以探讨细胞中发生的动态行为和复杂的相互作用。最好的解决办法是整合来自多个工具的图像。

图一:过去几年间,科学家陆续发布了多种复杂蛋白质复合体的原子结构。a。一种控制昼夜节律的蛋白质复合体。b。一种可感知耳中压力变化、使我们听到声音的感应器。c。寨卡病毒。

这项工作最突出的是科学家能快速地将功能与结构联系起来,而且他们能把成像方法结合起来。一个多世纪以来,结构生物学的首选方法一直是X射线晶体衍射法。但有些生物分子太大或太小,难以结晶,因此不能采用X射线法。而且,一些分子在发挥功能时,会发生形态或朝向的变化,而结晶法无法捕捉这些变化。

到了上世纪1980年代,X射线晶体学成像方法得到了核磁共振(NMR)技术的帮助,用于研究固体状态或者溶液中的蛋白质结构。这项技术不仅揭示蛋白质的结构,还能研究蛋白质的运动及其与其他分子之间的相互作用。正是因为有了这两种技术的帮助,我们现在才会有囊括了数以千计生物分子模型的数据库可以使用,这些数据库现在被应用在从技术研究到制药公司的各行各业。

Nogales等人使用的混合策略达到了10埃的整体分辨率,相比于以往分析的30埃分辨率是极大的进步。分辨率的提高带来了新视角,正如Nogales所说,“我们可以看到氨基酸与DNA的相互作用”。

最初,研究小组试图在零下196摄氏度的液氮中玻璃化微小水滴,但一直没能成功,最后用乙烷代替液氮后才最终实现,而乙烷本身则需要先用液氮来进行冷却。在显微镜下,他们观察到一种前所未见的情景。他们一开始认为这应该是乙烷,但是当液滴经过轻微加热,其分子却突然出现重新排列,形成了一种熟悉的冰晶结构。这是一项重要的成就,因为当时很多研究人员认为不可能实现水滴的玻璃化,而现在我们认为,玻璃化的水是宇宙中最常见的水的形式。

另一个可能阻碍该领域的威胁是专业知识。Meiler指出,“技术需要投资,但在培训科学家上进行投入也非常重要。”他建议,结构生物学领域的学生都去学习每一种方法的优缺点,并至少精通一种方法。“我们需要培养新一代科学家理解如何整合这些不同的技术。”

必赢娱乐棋牌,通过这种方法,弗兰克获得了一系列高分辨率的二维图像。这些图像展示的是同一种蛋白质,但是角度不同。整套算法软件到1981年终于完成。下一步,弗兰克必须弄清楚这些不同角度的二维图像之间是如何相互关联的,基于这些信息,他要尝试将这些二维图像合并并构建三位立体图像。弗兰克在1980年代中期对外发布了部分他开发的图像算法,并基于这一算法发布了核糖体的表面结构模型,这是一种在细胞内的细胞器,主要功能是合成蛋白质。

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这是电子显微镜领域令人振奋的一项突破,但是图像仅能显示核糖体轮廓。坦白地讲,它更像一团色块,分辨率上完全不能与X射线晶体学的原子级分辨率相提并论。

为了探讨数据组织、共享和使用的最佳方式,几十名结构生物学家于2014年10月齐聚英国欧洲生物信息研究所。Schroder表示,目前,PDB存储单个蛋白结构的数据,应该增加蛋白质所有方面的数据。细节越丰富,越有助于全面解析蛋白和大分子功能。

除此之外,电子显微镜需要用到真空腔,而这也不适合应用于生物分子,因为在这样的环境下生物分子周围的水会迅速挥发掉。而当生物分子干涸时,它们的结构将崩塌,丧失自然结构特征,从而让成像结果变得毫无意义。所有这一切几乎都在告诉亨德森,他的大胆尝试注定将要失败。但是,他的尝试却由于他当时选中进行研究的蛋白质类型比较特殊而出现了转机,他研究的对象是细菌视紫红质。

同时,Nogales和Doudna团队也使用混合方法研究R环。Nogales表示,“高分辨率的X射线晶体法无法解析完整的R环结构。”所以他们用冷冻电镜在低分辨率上对完整的环结构进行解析。只有把两者结合起来,研究人员才能真正揭示CRISPR-Cas9中R环的作用。

在过去的数年间,大量令人惊叹的分子结构充斥着各类文献(如图一):沙门氏菌用于侵袭细胞的注射端;导致化疗以及抗生素失效的蛋白质结构图;以及掌管生物昼夜节律的复杂分子结构等等。这里所展示的还只不过是冷冻电镜技术(cryo-EM)应用领域内很少的案例。当研究人员开始怀疑寨卡病毒和发生在巴西境内导致大量新生儿出现大脑损伤的“小头症”有关联时,他们利用冷冻电镜技术对病毒进行了直接成像。在短短数月内,原子层面分辨率的寨卡病毒的立体三维图像便产生出来了,科学家们基于这些成果迅速研发相应药物。

结构生物学家也使用混合方法解析超大复合体——这是过去无法完成的任务。Kornberg最新的成果进一步拓展了其对RNA聚合酶II的研究,并使用混合方法描述了一个由50多个蛋白质和转录因子组成的巨大复合体。“通过多个方法的结合,他们首次看到了整个复合体。每个方法的贡献同样大。”他说。

理查德·亨德森尝试成像的第一种膜蛋白难以制备足够用量的样本,而第二种膜蛋白则难以结晶。在经过数年的徒劳沮丧之后,亨德森开始尝试他最后的一种“杀手锏”——电子显微镜。在当时,电子显微镜是否真的能够在这一领域使用仍然是一个有争议的话题。这项技术被称为透射电镜,其原理或多或少与传统的显微镜类似,不同的只是会有一束电子束流射向样品,而不是传统显微镜那样是一束光线。

最近,Nogales和同事、分子生物学家、CRISPR-Cas9的联合发明人Jennifer
Doudna的合作项目正是个好例子。她们都对R环十分感兴趣。很多情况下,在DNA被CRISPR-Cas9剪切前,细胞内会形成一个由核苷酸构成的R环。Nogales等人对化脓性链球菌中的R环进行了成像,得到了近原子分辨率的结构图像,提示了Cas9酶在特定位点如何打开DNA,并使其可用于CRISPR的分子剪刀。

现在,让我们把时间再回溯到1978年,此时的弗兰克正忙于完善他的图像处理算法软件,而就在这一年,今年诺贝尔化学奖的第三位获奖人雅克??杜邦内特被设在德国海德堡的欧洲分子生物学实验室录用了。杜邦内特将要解决的是电子显微镜领域的另外一个基础性问题:当被放置于真空腔内时,生物样本是如何干涸并遭到破坏的?

德国欧洲分子生物学实验室细胞生物和生物物理部主任Jan
Ellenberg表示,这个时代对很多生命科学家来说,是梦想成真的时代。这个梦想是从原子层面无缝衔接到细胞层面。针对细胞大分子的深入理解自然能解答结构生物学的首要问题:一个分子的结构是怎么和其功能联系在一起的?

电子的波长远小于光子,因此电子显微镜能够分辨非常微小的结构——甚至是单个的原子。理论上讲,电子显微镜的分辨率要满足亨德森拍摄膜蛋白结构的需求是绰绰有余的,但是在现实中,这一目标却几乎是无法实现的。

此外,许多蛋白质,例如细胞膜上的药物靶点,是灵活而不稳定的。为了让这些蛋白质形成晶体,研究人员经常要在某种程度上改变它们。Meiler指出,改变样本可能无法准确反映分子的原生态以及其在细胞内的排布方式。他把实验和计算方法结合,以便更好地理解分子结构。“晶体法是很好的初始方法,但这个方法不足以提供功能方面的信息。”他说。

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与其他结构生物学家一样,Eva
Nogales赶上了好时机。这位美国加州大学伯克利分校的教员现在可以利用新工具,解决几年前根本无法解答的细胞分子机制问题。

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开启结构交响乐 科学家用混合方法了解细胞动态与功能

与此同时,在大西洋的彼岸,纽约州卫生署。约阿希姆·弗兰克也一直在思考着同样的问题。在1975年,他发展出一种理论方法,能够将电子显微镜获得的二维平面模糊图像进行分析和叠加处理,最终得到更高分辨率的三维立体图像。但弗兰克最终花费了超过10年时间才逐渐将这一方法一步步完善。

这种混合或综合性方法有助于研究人员深入研究基础科学问题,对药物开发者也非常有用。细胞膜上的大蛋白质往往是治疗靶标,高分辨率混合方法能揭示药物与受体相互作用的原子细节。同样,通过展示艾滋病病毒、埃博拉病毒和其他病原体的包膜蛋白与免疫细胞相互作用机制,能有助于疫苗发展。纳什维尔范德堡大学结构生物学家Jens
Meiler表示,这些结构对人们理解免疫系统的工作机制非常重要。

另外,很多分子是很难制备成晶体样本的,这一缺陷最终让理查德·亨德森在1970年代下决心放弃X射线晶体学方法——而这,正是今年诺贝尔化学奖获奖成果故事的开端。

Noglaes总结到:“这是混合方法的黄金时代。”

冷冻电镜最重要的问题是拍摄图像的质量较低。1991年,约阿希姆??弗兰克使用杜邦内特的玻璃化方法成像核糖体,并使用自己的软件分析这些图像,他获得一个分辨率为40??(??=
10^-10m)的三维立体图像。

这种方法得到了诸多追随者。斯坦福大学结构生物学家Roger
Kornberg指出,每个方法都能提供一些重要信息,结合起来,就能实现1+1>2的效果。由于在揭示基因转录机制方面的贡献,Kornberg于2006获得了诺贝尔化学奖。对于这一突破性研究,他使用的是X射线晶体衍射法。现在,和其他晶体学家一样,他开始使用多种方法的结合。

然而,这两种技术都有着基础性缺陷。对溶液内样品使用核磁共振技术对样品本身有限制,它只能应用于相对较小的蛋白质。而X射线晶体学方法要求必须首先将样品制作为晶体,比如进行低温冻结。即便如此,最终拍摄出来的图像看上去的效果仍然就像早期相机拍出的黑白照片,科学家们很难从这些模糊不清的图像中提取到关于蛋白质动态下的有价值信息。

Kornberg继续分析RNA聚合酶II,但现在他把冷冻电镜和晶体学技术结合起来。与晶体技术相比,冷冻电镜可用于不易结晶的生物分子,并且能解析较大的分子,但目前分辨率则稍逊一筹。Kornberg实验室还使用化学交联和质谱法,揭示邻近蛋白质之间的关系以及利用已知蛋白质信息进行同源性建模。

文章转载自https://www.ithome.com/html/discovery/328710.htm:[新浪科技](https://link.jianshu.com?t=http://tech.sina.com.cn/d/2017-10-04/doc-ifymmiwm5339519.shtml)作者:**晨风/悠悠**责编:**守一**

另一个障碍是多类数据集的共享和利用。任何一个技术都能得到丰富的信息,因此信息共享是个挑战。冷冻电镜生产商FEI公司的首席科学家Jeffrey
Lengyel表示,“每天都能生成百万兆字节的数据”。他希望,结构生物学领域可以向高通量的遗传生物学领域学习处理数据超载的方法。虽然有能灵活结合高分辨率晶体结构数据和冷冻电镜图的软件,但其他方法得到的数据无法简单地混合。例如,电子顺磁共振光谱测量高分子的距离和方向,而冷冻电镜产生密度图。虽然这两种数据结合在一起非常有用,但这两种数据语言并不相同。Meiler提出疑问,“我如何整合这些数据,如何分享?”

然而,很大程度上是由于理查德·亨德森坚信有朝一日电子显微镜将能够提供原子层面分辨率的图像并不断进行着尝试,电子显微镜技术经历着不断进步,它的分辨率正一埃一埃地不断改善,最后一个障碍在2013年被成功突破——一种全新的电子显微镜问世了(图六)。

虽然不同的方法能带来更多信息,但混合也会造成错误的叠加。因此,混合方法的一个潜在问题是,多个错误来源造成的误差增加。Meiler指出:“我关注的是如何在整合方法的同时,减小误差,保证得到的模型具有准确性、精度和可靠性。”

水的蒸发问题让人为难,然而雅克??杜邦内特却看到了一个潜在解决方案:快速冷却水,使其在液态形式下固化,形成一种玻璃,而不是晶体。

X射线晶体衍射一直是确定蛋白质原子结构的标准方法。在成立于1971年的蛋白质数据银行拥有的大约12万个模型中,约有90%来自晶体学研究。

图二:图为1975年发布的首个细菌视紫红质粗略模型。图源《自然》第257期28至32页。

德国复杂系统研究所计算结构生物学小组组长Gunnar
Schroder指出,蛋白质不仅仅是一个单一的静态结构,“通常情况下,你想看到的是整个蛋白质如何工作”。Schroder使用混合方法理解蛋白的行为和彼此间的联系。晶体技术能提供蛋白在脱离正常环境时的快照。但结构生物学家需要其他方法补充晶体结构信息,并提高他们对蛋白质形态和功能的理解。

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约阿希姆·弗兰克的图像处理方法对于冷冻电镜技术的发展是基础性的。

约阿希姆·弗兰克的方法(图四)基本原理是让计算机去自动分析电子显微镜获得的模糊二维图像,识别其中的蛋白质与周遭背景。他开发出一套数学方法,能够让计算机识别在图像中反复出现的模式。随后计算机将相类似的图像模式归类到一起并将这些图像中的信息进行合并叠加,从而生成更加清晰地图像。

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